QC lab - kennisdatabase

HILIC is ideaal voor polaire en geladen analyten, biedt hoge gevoeligheid in LC-MS en is compatibel met RP-SPE. Toch vereist het een zorgvuldige methodeontwikkeling vanwege het complexe retentiemechanisme.

1. Principe van de HILIC-methode

Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography (HILIC) is een techniek bedoeld voor de scheiding van polaire en ionische stoffen.
Stationaire fase: polair karakter (vergelijkbaar met NP-HPLC).
Mobiele fase: relatief apolair, met een hoog aandeel organische component (70–95% ACN).
Het mechanisme omvat waterstofbruggen, elektrostatische interacties en de invloed van de zogenaamde “stagnante waterlaag”.

2. Stationaire fase

Er bestaan verschillende types:

Neutraal: diol, amide, cyano.
Zwitterionisch: sulfobetaïne, fosfocholine.
Geladen: silica, aminopropyl.

Vormen van sorbenten:

Volledig poreuze deeltjes (1,7–10 µm).
Oppervlakte-poreuze deeltjes (core-shell) – lagere druk, hogere efficiëntie.
Monolithische kolommen – lage tegendruk, geschikt voor hoge stroomsnelheden.

3. Mobiele fase

Organische component: ACN (meest gebruikt), methanol, ethanol.
Waterige component: mierenzuur/azijnzuur, buffers (ammoniumacetaat/formiaat).
pH: beïnvloedt retentie – basische stoffen ↑ retentie bij hogere pH, zure stoffen ↓.
Bufferconcentratie: hogere concentratie beperkt ionische interacties.

4. Ontwikkeling van de HILIC-methode

Stappen:

Informatie over analyten (log P, pKa, MW).
Basisinstellingen (monsteroplosmiddel, type injectie).
Screening van condities (verschillende stationaire fasen, pH).
Optimalisatie (gradiënt, temperatuur, buffers).

Belangrijke factoren:

Kolomequilibratie – kan tot 1 uur duren.
Monsteroplosmiddel – invloed op piekvorm.
Temperatuur – hogere temperatuur verlaagt meestal retentie.

5. Voordelen en nadelen van HILIC

Voordelen:

Uitstekende retentie van polaire stoffen.
Lage tegendruk, geschikt voor MS-detectie.
Orthogonaal aan RP-HPLC (mogelijkheid voor 2D-LC).

Nadelen:

Langzamere stabilisatie van evenwicht.
Complex mechanisme van scheiding.
Gevoeligheid voor monsteroplosmiddel en geïnjecteerd volume.

6. Praktische toepassingen

Biologische geneesmiddelen: analyse van eiwitglycosylering.
Metabolomica, proteomica: suikers, aminozuren, peptiden.
Geneesmiddelen en metabolieten: TDM, forensische analyses.
Multianalysemethoden: antivirale middelen, vitaminen.
Klinische analyse: biomarkers.