Zde najdete vše potřebné o HILIC HPLC

HILIC je ideální pro polární a nabité analyty, nabízí vysokou citlivost v LC-MS a je kompatibilní s RP-SPE. Přesto vyžaduje pečlivý vývoj metody kvůli složitému retenčnímu mechanismu.

1. Princip metody HILIC

Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography (HILIC) je technika určená pro separaci polárních a iontových látek.
Stacionární fáze: polární charakter (podobný NP-HPLC).
Mobilní fáze: relativně nepolární, s vysokým podílem organické složky (70–95 % ACN).
Mechanismus zahrnuje vodíkové vazby, elektrostatické interakce a vliv tzv. „stagnantní vodné vrstvy“.

Stacionární fáze (polární povrch, např. diol) drží vodní film.
Mobilní fáze je převážně ACN s trochou vody → polární analyty interagují s vodní vrstvou.
Rozdíly v polaritě a vodíkových vazbách určují retenci.

2. Stacionární fáze

Existuje několik typů:

Neutrální: diol, amid, kyano.
Zwitteriontové: sulfobetain, fosfocholin.
Nabité: silikagel, aminopropyl.

Formy sorbentů:

Plně porézní částice (1,7–10 µm).
Povrchově porézní částice (core-shell) – nižší tlak, vyšší účinnost.
Monolitické kolony – nízký zpětný tlak, vhodné pro vysoké průtoky.

3. Mobilní fáze

Organická složka: ACN (nejčastěji), methanol, ethanol.
Vodná složka: kyselina mravenčí/octová, pufry (amonný octan/mravenčan).
pH: ovlivňuje retenci – zásadité látky ↑ retence při vyšším pH, kyselé látky naopak ↓.
Koncentrace pufru: vyšší koncentrace omezuje iontové interakce.

4. Vývoj HILIC metody

Postup:

Informace o analytu (log P, pKa, MW).
Základní nastavení (rozpouštědlo vzorku, typ nástřiku).
Screening podmínek (různé stacionární fáze, pH).
Optimalizace (gradient, teplota, pufry).

Klíčové faktory:

Ekvilibrace kolony – může trvat až 1 hodinu.
Rozpouštědlo vzorku – vliv na tvar píku.
Teplota – vyšší teplota obvykle snižuje retenci.

5. Výhody a nevýhody HILIC

Výhody:

Výborná retence polárních látek.
Nízký zpětný tlak, vhodné pro MS detekci.
Ortogonální k RP-HPLC (možnost 2D-LC).

Nevýhody:

Pomalejší ustalování rovnováhy.
Komplexní mechanismus separace.
Citlivost na rozpouštědlo vzorku a dávkovaný objem.

6. Praktické aplikace

Bioléčiva: analýza glykosylace proteinů.
Metabolomika, proteomika: sacharidy, aminokyseliny, peptidy.
Léčiva a metabolity: TDM, forenzní analýzy.
Multianalytové metody: antivirotika, vitamíny.
Klinická analýza: biomarkery.