Zde najdete vše potřebné o HPLC na reverzní fázi

Princip RP‑HPLC (Reversed‑Phase High‑Performance Liquid Chromatography)

Reverzně‑fázová HPLC je nejpoužívanější chromatografická technika v analytických laboratořích. Pracuje na principu rozdílné polarity analytů a jejich rozdílné interakce s nepolární stacionární fází.

1. Stacionární fáze (kolona) – nepolární / hydrofobní

V RP‑HPLC je kolona naplněna nepolárními (hydrofobními) částicemi, nejčastěji: C18 (octadecylsilika, ODS) – nejběžnější, C8, Fenyl, C4, cyano (zvláštní aplikace)

Klíčový princip: Čím je molekula více hydrofobní, tím silněji se váže na stacionární fázi a tím déle se z kolony eluční.

2. Mobilní fáze – polární

Mobilní fáze je polární směs:
voda (často s pufrem)
organické rozpouštědlo (acetonitril nebo methanol)

A často obsahuje i modifikátory: kyselina mravenčí, kys. trifluoroctová (TFA), fosfátové pufry atd. Vliv organiky na separaci:
Zvýšení % ACN/MeOH → rychlejší eluce → kratší retenční časy
Snížení % ACN/MeOH → delší retence → lepší oddělení hydrofobních složek

3. Princip separace

Separační mechanismus je založen na hydrofobní interakci mezi analytickými molekulami a nepolární stacionární fází.

Postup:

Vzorek se vstříkne do toku mobilní fáze (injektor).
Analytické molekuly se dostanou do kolony.

Molekuly:

hydrofobní → silně interagují s C18 povrchem → délka retence ↑
hydrofilní → málo interakcí → eluce rychlejší
Mobilní fáze postupně „odmývá“ látky podle jejich hydrofobnosti → vzniká chromatogram.

4. Izokratický vs. gradientový režim

Izokratický režim

Složení mobilní fáze konstantní
Stabilní retence, vhodné pro jednoduché směsi

Gradientový režim

Postupně zvyšované % organiky (např. 5 → 95 % ACN)
Lépe eluční látky s různými polaritami
Zrychlení analýzy a lepší rozlišení složitých směsí

5. Detekce

V RP‑HPLC se nejčastěji používá:
UV/Vis detektor (DAD, PDA)
Fluorescenční detektor
MS detektor (LC‑MS systém)

Princip zůstává stejný: každá analyzovaná látka má specifický retenční čas + signál v detektoru, což umožňuje identifikaci a kvantifikaci.

6. Výhody RP‑HPLC

univerzální metoda (léčiva, metabolity, peptidy, vitaminy…)
vysoká reprodukovatelnost
možnost gradientu → řešení komplexních směsí
kompatibilní s UV i MS detekcí

7. Shrnutí jednou větou

RP‑HPLC separuje molekuly podle jejich hydrofobnosti: čím více je látka „nepolární“, tím déle drží na C18 koloně a tím později eluuje.